Harley Quinn (med stemme af Kaley Cuoco) har endelig slået op med jokeren, og nu forsøger hun at få sit eget navn etableret blandt Gotham Citys kriminelle og dermed score en plads ved bordet hos The Legion of Doom. Hun får hjælp af sin kriminelle veninde Poison Ivy, og undervejs støder hun naturligvis ind i alle de andre klassiske Gotham-skurke som The Riddler, Two-Face, Mr. Freeze og den værste skurk af dem alle, ham den der forfærdelige Batman!